更能協助生命科學領域的探索
趙盈婷／國立中央大學生醫科學與工程學系系統生物與生物資訊博士候選人。
許藝瓊／國立中央大學生醫科學與工程學系副教授。實驗室主要開發以統計實驗方法結合人工智慧，針對疾病資料進行分析與預測期望能獲得多層次的生物標記。
去氧核糖核酸（DNA）是生物體中重要的遺傳物質，當中隱藏的各種遺傳密碼，令許多研究者既興奮又期待，只想一窺這複雜的生物奧祕。於是在 1990 年美國發起了人類基因體計畫（Human Genome Project, HGP），更在 2003 年宣告完成完整人類基因組解碼。不過要完成這些艱困的任務，有個先決技術必須克服——該怎麼解密 DNA ?我們要如何知道 DNA 的序列？
第一代核酸定序技術的誕生
1953 年，美國分子生物學家華生（James Watson）與英國生物學家克里克（Francis Crick）破解了 DNA 的結構，也讓生物學研究從巨觀的生物現象及以外觀表徵判斷疾病或種間差異，轉而以微觀的分子生物取而代之。到了 1977 年，英國生物化學家桑格（Frederick Sanger）發明了名為「鏈終止法」（chain-termination method）的第一代核酸定序技術，使得核酸定序成為生物技術發展的重要基礎，桑格也因此榮獲 1980 年的諾貝爾化學獎。
此 DNA 定序技術的原理是在 DNA 合成的過程中，其原料為去氧三磷酸核苷酸（deoxyribonucleotide，亦稱 dNTP, 如 dATP、dGTP、dCTP、dTTP），若是能利用合成 DNA 原料的差異，將原本的去氧三磷酸核苷酸改變為「雙去氧三磷酸核苷酸」（dideoxynucleotide，亦稱 ddNTP，如 ddATP、ddGTP、ddCTP、ddTTP），進而終止 DNA 繼續合成的過程，就能藉由分析終止的產物片段，反推其序列（圖一）。桑格發明的定序方法在現代稱為第一代定序，為分子生物學領域當中最基本的 DNA 解碼工具，使用方法簡單快速且反應成本較低。
▲圖一：桑格定序的原理
更快、更有效率、成本更低的「次世代定序」
隨著定序技術的演進，美國在 1990 年發起了人類基因組計畫。第一代定序技術在通量、大量定序所耗費的成本及速度上，已無法滿足日益增長的大規模全基因組定序需求。因此在 2005 年，次世代定序技術（next generation sequencing, NGS）被推出，由於此技術可同時定序大量 DNA，進而提升通量、降低成本、增加速度。
早期市面上的 NGS 定序儀有 Illumina、ABI、Roche 這 3 家廠牌，不過隨著時間的演進，目前科學期刊當中，約 70% 以上採用 Illumina 平臺作為定序工具。Illumina 的定序技術主要是利用大量的 DNA 短片段定序序列，利用物理性方式將 DNA 打斷成大約 300～500 個鹼基的小片段，並在兩端接上轉接子（adaptor），再把含有轉接子的序列，鋪到上方有轉接子互補序列的晶片上，透過橋式聚合酶鏈鎖反應（bridge PCR）進行擴增。再經由標記不同鹼基的特定序列，移除螢光分子的 dNTP 與反應試劑，重覆進行螢光標記移除與偵測，達到快速且大量的定序結果（圖二）。最後再用生物資訊技術分析資料，判別出每一條序列的正確鹼基對。
▲圖二：Illumina 定序的原理
由於 NGS 的快速發展，根據美國國家衛生研究院（National Institutes of Health, NIH）統計，近 20 年來每百萬鹼基定序的成本已從 5,000 美元大幅降至 0.01 美元；人類全基因體定序成本也從一個人近億美元降至 1,000 美元以下。使得 NGS 成為不僅用於精準醫學的重要技術，甚至還能用於生命科學相關領域的 DNA 探索。
而另一個應用的範疇，則是透過 NGS 研究特定環境下微生物的組成，與其相對數量。由於微生物是一種難以用肉眼直接看到的微小生物，早期需要先藉由人工培養，再以顯微鏡來觀察進行研究。
過去，估計只有約 1% 的環境細菌能夠在實驗室環境下培養，近來也因技術上的經驗積累，把可培養的細菌種類提高至 50%。而在 1998 年，由漢德爾斯曼（Jo Handelsman）提出來的總體基因體學（metagenomics），意即是環境中所有微生物遺傳物質的總和，且拜 NGS 定序技術所賜，大幅降低了原本 DNA 定序所需要花費的時間與經費，讓科學家們能看到那些無法從實驗室培養的微生物。
目前主要有兩種定序的方式應用於總體基因體學研究，第一個是入門款，利用細菌本身特有的區域片段進行定序，稱為 16S rRNA 定序。16S rRNA 是細菌細胞的一個核醣體小次單元（ribosomal small subunit），當中有 9 個變異區 v1～v9，如圖三中間的紅色方框區塊，大部分會定序 v4 或是 v3～v4 這個變異區，來對這些細菌做身分鑑定。另一個定序方法則是全基因體霰彈槍定序法（shotgun sequencing），與人類基因組解碼的方法類似，只不過起始的素材是人體與微生物的混和基因體，定序完成後的序列，會再經由生物資訊的分析，過濾掉人類的基因，剩下的即是與人類共存微生物的所有基因序列，再進行下一步的比對及功能性分析。比起 16S 定序，全基因體霰彈槍定序法能夠讓我們更全面了解微生物的組成和基因分析。
▲圖三：細菌細胞中的 9 個變異位置
次世代定序，看透你的腸道健康
在人類基因體計畫後，美國腸道協會（American Gut Consortium）於 2012 年發起了另一個大規模的定序計畫——美國人腸道菌計畫（American Gut Project），並開始收集超過 1 萬多名健康受試者的皮膚、鼻腔、口腔、腸胃道，以及泌尿道樣本。由於人體當中的微生物不像實驗設計中那般單純，每個人的飲食習慣、生活方式，以及健康狀況等都有很大差異。若能藉由這個計畫，採集上萬筆人體資料並透過 NGS 的定序技術，我們便能建立一個全面性的人類微生物體學資料庫。當美國腸道協會於 2018 年發表全球第一個規模最大的研究報告時，頓時引起了全世界對於微生物的更大興趣，也藉此使大眾了解微生物學的複雜度，其實無法靠單一門研究就得出結論。
如同我們前面所提到的，此計畫利用了 Illumina miseq 平臺的 16S rRNA 特定段區域 V4 進行定序，首先辨認出樣本間微生物的組成。另外也將部分樣本利用當時最大的定序平臺——Hiseq2500 進行總體基因體學定序，以及高效液相層析質譜儀（HPLC-MS）進行其代謝產物的分析，加上受試著臨床的資訊，例如飲食習慣、生活方式、健康狀況等資料，利用統計方式計算出個體間微生物組成與飲食、健康行為之間的關係。
人體的消化道中，約有 500～1,000 種的微生物菌叢。這些腸道微生物對於人體的生理功能十分重要，腸道可說是「人類的第二個大腦」。透過 NGS 的分析結果，一些人體微生物有趣的數字也就此為大眾所知，例如人類約有 22,000 種基因，但人體中的微生物基因卻是我們基因的 100 倍，存在 10 億到 1 兆的微生物菌叢，更有 90% 的疾病都是由微生物所引起的；人與人的基因差異只有 0.1%，不過個體間的微生物差異卻高達了10～20%！
以兩個微生物定序，應用於我們周遭生活的事件為例。臺灣的慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）盛行率高達 11.9%，僅次於日本和美國，洗腎人口更是全世界第一，甚至還獲得「洗腎王國」的稱號。而腸道微生物群落的變化與功能的改變，以及腸道屏障功能損傷造成的腸道菌群失調，常見於慢性腎病患者中。失調的腸道菌群代謝產物，例如尿毒素（uremic toxins）會大量地被釋放到人體血液中，並經由血液循環來到身體各個部位，到了腸胃道時會造成腸道屏障被破壞，讓尿毒素更容易進入全身循環。
近期越來越多文獻指出，罹患 CKD 和微生物菌叢之間存在雙向關係。腸胃道不好的微生物菌叢組成和結構的變化，會產生過多的尿毒症毒素。而不良的微生物代謝產物，更會產生自由基在人體內產生高的氧化壓力或有機酸，造成全身性的發炎反應，導致體內的離子失衡。因此，惡化的 CKD 患者的腎功能，常伴隨較高的心血管疾病風險和死亡率。對於這些病情較為惡化的患者，在臨床上新的治療方式，是採用糞便微生物移植（faecal microbiota transplant) ，能對特定不良的微生物產生干預作用。而另一派說法則是建議患者補充益生菌，利用改善飲食習慣的策略，改變腸胃道益生菌群的組成，進而延緩這些慢性疾病的惡化。
環境微生物也能用次世代定序分析！
微生物的重要性不僅是對於人體健康，在環境中也扮演著重要角色。筆者實驗室於 2021 年於《交叉科學》（iScience）期刊上刊登的一篇文章，討論地震土中土壤液化與其中微生物群的關係研究。
該項研究的土壤取樣為 2010 年，發生在高雄地區的甲仙大地震，當時高雄區的震度達到 4 級，透過地質學加上地理學的物理探測方式，我們發現在地底下 7 公尺處有土壤液化的現象，是在別層土壤中沒有觀察到的。因此利用 16S 定序方法，對於每一層土壤的微生物進行身分鑑定，發現在土壤液化那一層，有大量的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）細菌，而硝化螺旋菌屬細菌的一種硝化細菌（nitrifier），可以將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽。防止液化的傳統方法是以人工技術把氮氣打入土壤層，防止水分子進入土壤，我們發現這株硝化螺旋菌的主要功能，是將土壤的氮氣藉由與氮分子的代謝，使得氮分子變成硝酸鹽，讓原先存在於土壤的水分子，經由土壤空隙滲入土內，最終導致土壤液化。由於傳統的物理學採樣曠日廢時，且需要投入大量的人力與儀器成本，此項以微生物特性為基礎的土壤液化監測方法，其特徵在於藉由分析土壤中微生物的差異以及進行菌相分析，判讀出土壤液化的特定菌相組成，供土木營建領域的人員不同面向的監測數據，增加分析的完整度。
微生物研究可應用於不同的領域，再加上既有 NGS 定序技術的成熟，讓各個領域的研究學者趨之若鶩。微生物對於生命的影響，如同魔鬼藏在細節裡，眼睛看不見的，不代表不存在。看完是不是覺得這是一個非常有趣的研究主題呢？
延伸閱讀
Ying Ting Chao et al., A potential microbiological approach to the evaluation of earthquake-induced soil liquefaction, iScience, Vol.24(9): 102984, 2021.
用程式寫未來的精準醫療，生物醫學資訊科技帶領醫療數位轉型：下一篇⇢
本文轉載、修改自《科學月刊》2022 年 4 月
