黃子懿∕臺灣大學醫學系二年級生。

陳佑宗∕臺灣大學基因體暨蛋白體醫學研究所副教授。

 

 

 

2020 年諾貝爾化學獎由美國生化學家道納（Jennifer Doudna）和法國微生物學家夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）共享殊榮，兩人因「開發編輯基因體的方法」而獲獎。事實上，兩位致力研究的是近年相當熱門的 CRISPR-Cas 基因編輯系統。接下來，我們將從 CRISPR 的源頭開始介紹，探討道納和夏彭提耶如何發現 CRISPR-Cas 運用於基因編輯的可能性，並舉例說明這項研究對生物與醫學領域的影響。

 

 回到源頭——細菌基因體中神祕的重複序列 

1987 年，日本科學家發現大腸桿菌（Escherichia coli）基因體中有不尋常的重複序列。這些片段的序列完全相同，具有回文性質（palindrome），且彼此間固定間隔一段特殊序列。後來，科學家發現這是原核生物基因體中常見的結構，便依其特性而命名為常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）。

之後，他們推斷這段重複序列像是細菌的免疫系統，當細菌遭噬菌體感染卻幸運存活時，便會切取一小段噬菌體的 DNA，並儲存於 CRISPR 之間的間隔序列（spacer）。如果未來再次遭到噬菌體感染，由這些間隔序列和 CRISPR 重複序列所轉錄出的 crRNA（CRISPR RNA），會連同一群稱為 Cas 的蛋白質去識別此噬菌體，並摧毀其 DNA，科學家稱此破壞噬菌體基因的過程為干擾（interference，圖一）。

▲圖一：鏈球菌中 Class Ⅱ CRISPR/Cas 機制圖

 

在不同細菌中，CRISPR-Cas 的運作模式也不盡相同，主要可以分為兩大類：Class I 和 Class II。兩者最大的差異在於進行干擾時，Class I 需要多種 Cas 蛋白共同參與，有的負責鎖定目標核酸，有的則負責切割。而 Class II 則較為簡潔，只需要一種具有多個區域（domain）的 Cas 蛋白，就像是融合多種工具的瑞士刀，能執行干擾過程所需的各種功能。然而，細菌這樣的機制和基因編輯該如何產生關聯？這正是道納、夏彭提耶和她們團隊的重要突破。

 

道納好奇接觸 CRISPR

在夏威夷長大的道納，自幼即對大自然充滿疑問與好奇，中學時，她讀了諾貝爾生理醫學獎得主華森（James Watson）的著作，激發她對生物化學的興趣。1994 年，她在耶魯大學（Yale University）成立實驗室，兩年後即因確定一種 RNA 酶（ribozyme）的結構，而發表於《科學》（Science）期刊並獲得學界關注。之後，她到加州大學柏克萊分校（University of California, Berkeley），繼續研究 RNA 及 RNA 干擾（RNA interference, RNAi）。在那裡，她第一次接觸到 CRISPR 這個當時相當冷門的領域。

2006 年，同在柏克萊分校的地球科學家班菲爾德（Jillian Banfield）來電，想邀請道納加入研究 CRISPR 的行列。完全沒聽過這個名詞的道納閱讀了當時相當有限的資料，而好奇於這特殊的干擾機制以及 Cas 酵素的潛在功能，於是她答應了邀約，並著手研究 Class I CRISPR-Cas。2009 年，她的團隊發現一種能切割 DNA 的 Cas1 蛋白，並推測這種酵素可將噬菌體 DNA 插入 CRISPR 陣列中，等同免疫記憶的形成。之後，她逐漸將重心放在 Cas 蛋白如何切割病毒 DNA。儘管屢有突破，道納仍知道自己研究的侷限性，她希望能更瞭解較為簡潔的 Class II CRISPR-Cas，而遇見夏彭提耶正好提供了新的研究機會。

 

夏彭提耶與化膿鏈球菌

遠在地球另一頭的夏彭提耶，成長於法國巴黎附近的小鎮，小時候即立定志向希望能對醫藥界有所貢獻。曾在 1996 年至美國紐約洛克斐勒大學（Rockefeller University）和微生物學家托曼能（Elaine Tuomanen）研究肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae），托曼能曾稱讚她「總在尋求基因體中的意外發現」。2002 年，她返回歐洲，在維也納大學（University of Vienna）研究化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的致病性，她也開始思考 CRISPR 的機制。由於她的團隊先前曾找到調節化膿鏈球菌致病因子的 RNA，使她開始好奇化膿鏈球菌基因體中哪些區域會轉錄出調節 RNA（regulatory RNA），以及這些區域和 CRISPR 是否有關聯。

在和同事佛格爾（Jörg Vogel）合作下，他們意外觀察到一種大量表現且當時未知的非編碼 RNA（non-coding RNA），位置在 CRISPR 陣列上游，且轉錄方向相反，他們稱之為 tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）。進一步研究 tracrRNA 的序列，發現其會和 crRNA 配對在一起。之後，他們利用實驗證明 tracrRNA 和 crRNA 的成熟相關，且此機制涉及 Class II CRISPR-Cas 的 Cas9 蛋白（舊稱 Csn1）。此研究成果於 2011 年刊登在《自然》（Nature），由於過去科學界並沒想過 CRISPR 系統可能有兩種 RNA 分子共同參與，因此引起熱烈討論。

 

跨國團隊——《科學》期刊的震撼彈

2011 年春天，道納與夏彭提耶兩人一同到波多黎各參加美國微生物學會的年會。素昧平生的兩人，在共同朋友介紹下相識，兩人漫步於波多黎各首府聖胡安舊城區並聊起了自己的科學研究。夏彭提耶於是向道納提出合作計畫，希望結合道納在生物化學與結構生物學知識，一同釐清 Cas9 蛋白的功能。受到化膿鏈球菌中 Class II CRISPRCas 吸引，道納很快便接受邀請，仍在柏克萊做研究的道納，便與剛搬到瑞典于默奧大學（Umeå universitet）的夏彭提耶，開啟了跨國合作。

當時已知道 Cas9 對於細菌的 CRISPR 免疫運作相當重要，但其真正的角色仍不明，由過去文獻以及 Cas9 胺基酸序列分析，兩人的跨國團隊推測 Cas9 應該會受 crRNA 引導而切割外來 DNA。於是，道納的實驗室利用重組 DNA 的技術，在大腸桿菌中生產大量的 Cas9，再利用不同的層析方式純化出 Cas9。接著，他們將 Cas9、病毒 DNA 與 crRNA（其序列能和一段病毒 DNA 互補）混合，檢驗其假說是否正確。遺憾的是，實驗結果顯示病毒 DNA 並未受到切割。儘管如此，他們並未氣餒，不久後便有了重要發現：多加入夏彭提耶等人先前找到的 tracrRNA，便能使 Cas9 切割病毒 DNA 上和 crRNA 互補的序列！

接下來，兩人的團隊便好奇：是否可以透過改寫 RNA 序列來引導 Cas9 切割任何 DNA？為了測試此推測，他們首先設計一段 RNA 來連結 crRNA 和 tracrRNA，這段 RNA 會形成像髮夾的特殊立體結構（hairpin），使得 crRNA 和 tracrRNA 原本互補配對的結構不會受到影響，這樣的合體 RNA 稱為單一嚮導 RNA（single-guide RNA, sgRNA，舊稱 single chimeric RNA）。接著，他們從綠螢光蛋白（green-fluorescent protein, GFP）的基因挑選 5 段 20 個鹼基對長的序列，依次合成 5 個單一嚮導 RNA，再將 Cas9、sgRNA 和帶有 GFP 基因的質體混合。結果顯現所有 GFP DNA 都如預期地被切斷，這表示他們開發了一種只需兩個零件（Cas9 和 sgRNA）的基因編輯工具！興奮的團隊隨即統整實驗結果，將研究文章投稿至《科學》，短短二十天內即刊登，震撼科學界。幾乎在同一時間，立陶宛的希克席尼（Virginijus Šikšnys）團隊亦發表了類似的結果，卻成為本次諾貝爾獎的遺珠。

 

CRISPR-Cas 的未來與應用

CRISPR-Cas 相較於過去其他基因編輯工具（如鋅指蛋白或 TALEN）更為簡便，只需更改 sgRNA 前端 20 個鹼基對的序列，便能標靶不同基因，甚至能同時編輯多個基因。如今，有眾多科學家嘗試將 CRISPR-Cas 應用於不同層面，除了過去常提及的基因治療（gene therapy）和農作物改良外，在生物及醫學還有更多應用。例如，有團隊用 CRISPR-Cas9 在蚊子中進行基因驅動（gene drive），這是一種能使特定基因在族群中快速傳播的基因工程。他們修改蚊子某個和繁殖有關的基因，使其不孕，再將少數基因修改過的蚊子，放入野生型蚊子的籠子中，成功在八到十二代內使整個族群不孕，這項技術有望用於防治蚊子傳染的登革熱、瘧疾等疾病。事實上，比爾及梅琳達‧蓋茲基金會（Bill & Melinda Gates Foundation）底下的瘧疾計畫（Target Malaria），即投入高達 7,500 萬美元研究 CRISPR-Cas9 基因驅動。

另外，哈佛大學的邱吉（George Church）則成功利用 CRISPR-Cas9 剔除豬基因體中 62 段序列。這些序列主要為內源反轉錄病毒序列（endogenous retrovirus），是移植豬器官至人體的一大阻礙。邱吉之後更創立了 eGenesis 公司，持續進行此計畫。如果未來成功剔除所有相關序列，可藉此提高豬器官移植的安全性，來幫助等不到合適器官捐贈的病人。由上述可見，CRISPR-Cas 豐富的應用勢必將持續影響生命科學及醫學的研究發展。

 

純然的好奇心與意外的解答

CRISPR-Cas 的研究最初只是來自純然的好奇心，想了解細菌所演化出的巧妙防禦機制，卻意外找到基因編輯的工具，對於生物醫學領域造成衝擊。如同道納在受獎後所言「問題的解答常來自意外的方向」，此次諾貝爾獎給予 CRISPR-Cas 肯定，說明了基礎研究的重要性，也見證了自然萬物的奧妙。相信未來會有更多科學家，憑著好奇心、原創性和團隊合作，在基礎科學研究中找到重要突破。

 

▲CRISPR-Cas 已經漸漸走到臨床應用上，但目前仍處於臨床試驗早期，離實際應用還有一段距離。除了表中列出的遺傳疾病外，有些團隊則嘗試將 CRISPR-Cas 結合免疫療法，未來有望用於癌症治療。

 

延伸閱讀

1. Elitza Deltcheva et al., CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III, Nature, 471(7340), 602-607, 2011.

2. Giedrius Gasiunas et al., Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(39), E2579-E2586, 2012.

3. Martin Jinek et al., A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096): 816-21, 2012.

 

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